乳酸功能化3D打印PCL/nHA支架通過代謝-表觀遺傳串擾驅(qū)動BMSC成骨研究

1. 研究背景

創(chuàng)傷、感染或腫瘤切除導致的臨界尺寸骨缺損是臨床治療的重大難題。目前的金標準治療方案（如自體移植、異體移植）受限于供體短缺、免疫并發(fā)癥及感染風險，亟需合成替代材料。

組織工程策略（仿生支架結合干細胞）具有治療潛力，但仍存在未解決的問題：① 聚己內(nèi)酯（PCL）支架雖具備可調(diào)節(jié)降解性、力學耐久性及監(jiān)管批準資質(zhì)，但其固有疏水性和低生物活性需與生物活性成分（如天然骨主要無機成分納米羥基磷灰石nHA）復合；② 現(xiàn)有支架設計無法復刻天然骨組織的動態(tài)代謝相互作用；③ 常規(guī)常氧體外培養(yǎng)會損害骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的干性和成骨能力，而缺氧骨髓微環(huán)境可通過代謝適應維持這些特性。

乳酸在骨生物學中具有細胞類型依賴性雙重作用：對BMSCs可通過組蛋白H3K18乳酸化或嗅覺受體Olfr1440激活發(fā)揮促成骨作用，但對牙周膜干細胞則通過MCT1-mTOR介導的自噬抑制抑制成骨；同時乳酸還可調(diào)控免疫重編程（如誘導巨噬細胞向M2型極化）。然而，當前研究存在三大空白：① 尚無支架設計利用乳酸的促成骨潛力；② 組蛋白乳酸化以外的機制未被探索；③ 乳酸對成骨關鍵調(diào)控因子（如RUNX2）的影響未知。

2. 研究內(nèi)容

2.1 支架制備與表征

采用溶劑澆鑄結合3D打印技術制備PCL/nHA/SL復合支架，具體參數(shù)如下：

• 材料比例：PCL（70% w/w）、nHA（30% w/w），乳酸鈉（SL）濃度梯度為0.5%–5% w/w；
• 3D打印參數(shù)：噴嘴直徑200 μm，纖維直徑200±50 μm，孔徑330±50 μm，支架尺寸為Φ5 mm×2 mm（圓柱狀）；
• 后處理：60℃固化12小時，⁶⁰Co γ射線（25 kGy）滅菌，無菌PBS沖洗2次；
• 性能檢測：檢測1、3、7、14、21、28天的pH值、重量損失、Ca2?釋放量；37℃模擬體液（SBF）中搖瓶培養(yǎng)28天評估降解率，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）檢測離子濃度。

2.2 BMSCs分離與培養(yǎng)

使用人BMSCs（ATCC? PCS-500-012?），在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37℃、5% CO?），選用第3代細胞進行實驗；支架接種密度為4×10?個細胞/支架，分別采用基礎培養(yǎng)基或成骨誘導培養(yǎng)基（含0.1 mM地塞米松、8 mM β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸）培養(yǎng)，每3天換液。

2.3 生物相容性與細胞活力檢測

• 細胞活力：采用LIVE/DEAD?試劑盒（2 μM鈣黃綠素-AM、4 μM碘化丙啶）染色，Cytation5細胞成像儀觀察；
• 細胞增殖：CCK-8法檢測1、3、5、7天的吸光度（450 nm）；
• 細胞骨架分析：4%多聚甲醛（PFA）固定，0.1% Triton X-100透化，Alexa Fluor? 594-鬼筆環(huán)肽（F-actin，紅色）和DAPI（細胞核，藍色）染色，Zeiss LSM 880共聚焦顯微鏡（63×油鏡）觀察。

2.4 成骨分化評估

• 堿性磷酸酶（ALP）活性：采用p-硝基苯磷酸（pNPP）底物檢測7、14天活性，結果歸一化為總蛋白濃度（BCA法）；
• 鈣沉積：20 μM二甲酚橙（XO）和茜素紅S（ARS）染色，ImageJ定量熒光強度（德克薩斯紅濾光片）和礦化結節(jié)面積；
• 成骨標志物：Western blot檢測RUNX2、COL1A1、OCN、OPN（蛋白上樣量20 μg/泳道，抗體稀釋比1:1000）；
• 乳酸濃度：采用乳酸檢測試劑盒（Biovision, K607-100）檢測1、7、14、21天培養(yǎng)基中乳酸水平。

2.5 賴氨酸乳酸化蛋白質(zhì)組學

BMSCs在PCL/nHA/SL或PCL/nHA支架上培養(yǎng)14天后，提取蛋白并胰酶消化，采用抗K-Lac抗體偶聯(lián)磁珠富集乳酸化肽段，通過4D無標記LC-MS/MS（timsTOF Pro質(zhì)譜儀，Bruker）分析；使用MaxQuant（v1.6.15.0）匹配UniProt人類數(shù)據(jù)庫（2022），篩選差異乳酸化位點（FC>1.5，P<0.05），并進行GO/KEGG富集分析（Fisher精確檢驗，P<0.05）；手動驗證STAT1-K193乳酸化（Mascot評分>200，定位概率>99%）。

2.6 基因修飾與實驗組設計

采用慢病毒轉染（MOI=20，2 μg/mL聚凝胺孵育72小時）進行基因修飾，設計兩組關鍵實驗：

實驗1：STAT1乳酸化對STAT1-Runx2相互作用的影響（Table 1）

轉染后48小時進行機制檢測：免疫熒光檢測STAT1/Runx2共定位；Co-IP（STAT1抗體 pull-down）檢測乳酸化和Runx2結合；ChIP-qPCR檢測Runx2與骨鈣素啟動子的結合；Western blot檢測Runx2和OCN表達（GAPDH歸一化）。

實驗2：STAT1-K193R對乳酸誘導成骨的影響（Table 2）

成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后，檢測ALP活性、ARS礦化及Western blot（Runx2、COL1A1、OCN、OPN），全程定量乳酸水平。

2.7 STAT1乳酸化功能研究

• Co-IP：細胞裂解液與抗STAT1抗體（或?qū)φ誌gG）4℃孵育過夜，Protein A/G瓊脂糖珠 pull-down，免疫印跡檢測K-乳酸化（1:300）和STAT1（1:500）；
• 亞細胞定位：免疫熒光（抗STAT1抗體1:200，Alexa Fluor? 488/555二抗）檢測STAT1分布；
• 突變體轉染：Lipofectamine 3000將HA標記的STAT1突變體（K193R、K584R）轉染293T細胞；
• STAT1-RUNX2相互作用：ChIP（抗RUNX2抗體）結合骨鈣素啟動子特異性引物檢測。

2.8 體內(nèi)骨再生實驗

對SD大鼠（n=6/組）構建5 mm直徑臨界尺寸顱骨缺損模型，實驗組植入支架，對照組不處理；12周后取材，4% PFA固定，采用：① 顯微CT（Skyscan 1176）掃描，CTAn軟件定量新骨形成（BV/TV、Tb.N、Tb.Th）；② 組織學染色（HE、Masson三色染色）；③ 免疫組化（OCN、RUNX2）。

2.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以均值±標準差（n=3）表示，采用Student t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）結合Tukey事后檢驗（GraphPad Prism 9.0），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Fig. 1. PCL/nHA/SL支架中乳酸最佳濃度確定。（A）乳酸釋放動力學：PCL/nHA/SL支架的乳酸持續(xù)釋放與PCL/nHA支架的基線水平對比；（B）CCK-8檢測：0.5%–1%（w/w）乳酸維持細胞活力，5%乳酸顯著抑制增殖；（C）Western blot分析7天培養(yǎng)的早期成骨標志物（Runx2、COL1A1）；（D）Western blot分析14天培養(yǎng)的晚期成骨標志物（OCN、OPN）。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 2. 聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石（PCL/nHA）和聚己內(nèi)酯/納米羥基磷灰石/乳酸鈉（PCL/nHA/SL）復合支架的生物相容性評估。（A）模擬體液（SBF）中的pH值變化；（B）支架在SBF中的重量損失；（C）支架隨時間釋放的Ca2?濃度；（D）BMSCs在支架上培養(yǎng)1、3、5、7天的活/死染色（比例尺：300 μm；活細胞：綠色；死細胞：紅色）；（E）活細胞密度定量分析：兩組增殖動力學相當；（F）CCK-8檢測：細胞增殖呈時間依賴性，組間無差異（p>0.05）；（G、H）鬼筆環(huán)肽/DAPI染色及熒光強度定量：細胞骨架廣泛鋪展（比例尺：300 μm；F-肌動蛋白：紅色；細胞核：藍色）。（結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 3. 支架的成骨分化潛力。（A）XO染色（14、21天）顯示鈣沉積（紅色熒光，比例尺：300 μm）；（B）礦化面積（%）定量；（C）ALP活性時間曲線：PCL/nHA/SL支架促進早期分化，聯(lián)合成骨誘導處理（PCL/nHA/SL+OD）活性達峰值；（D）乳酸釋放動力學：PCL/nHA/SL支架的乳酸持續(xù)釋放與PCL/nHA支架的基線水平對比；（E）21天培養(yǎng)過程中成骨標志物（Runx2、COL1A1、OCN、OPN）的Western blot分析。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 4. 賴氨酸乳酸化蛋白質(zhì)組學。（A）乳酸化位點火山圖（PCL/nHA vs PCL/nHA/SL）：紅色/藍色分別表示上調(diào)/下調(diào)位點；（B）乳酸化蛋白的GO/KEGG富集分析（如骨化調(diào)控、成骨細胞分化、JAK-STAT通路）；（C）MS/MS譜圖驗證STAT1-K193乳酸化；（D）乳酸化位點序列基序分析：熱圖顯示乳酸化位點周圍的氨基酸偏好性。

Fig. 5. STAT1乳酸化功能表征。（A）免疫印跡檢測全局K-Lac水平；（B）Co-IP（抗乳酸賴氨酸抗體）驗證STAT1乳酸化；（C）STAT1亞細胞定位：PCL/nHA/SL組（7–14天）STAT1胞質(zhì)聚集，PCL/nHA對照組呈核-質(zhì)分布（比例尺：20 μm；STAT1：綠色；DAPI：藍色）；（D）環(huán)己酰亞胺追蹤實驗評估STAT1蛋白穩(wěn)定性；（E）免疫熒光顯示乳酸誘導STAT1胞質(zhì)轉運。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 6. K193乳酸化調(diào)控STAT1亞細胞轉運。（A）Co-IP驗證STAT1突變體的乳酸化水平差異；（B）HA標記STAT1變體的亞細胞定位：PCL/nHA/SL培養(yǎng)中，WT和K584R定位于胞質(zhì)，K193R滯留于核內(nèi)（比例尺：20 μm；STAT1：綠色；DAPI：藍色）。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05）

Fig. 7. 乳酸化依賴性STAT1-Runx2相互作用。（A）Runx2核轉運共聚焦成像：STAT1-KD細胞中Runx2核轉運增強，STAT1-OE抑制該過程，支架共培養(yǎng)可恢復（比例尺：20 μm；Runx2：紅色；STAT1：綠色；DAPI：藍色）；（B）Co-IP分析STAT1-Runx2結合；（C）STAT1-Runx2軸調(diào)控OCN表達；（D）ChIP-qPCR顯示乳酸化依賴性STAT1在Runx2啟動子的染色質(zhì)占據(jù)。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 8. STAT1乳酸化機制的基因驗證。（A）ARS染色（14天）顯示礦化差異；（B）14天成骨標志物和STAT1的Western blot；（C）STAT1-KD+K193R突變體組的ALP活性降低。（數(shù)據(jù)歸一化至β-actin；結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 9. 體內(nèi)骨再生性能。（A）12周組織學分析：HE染色、Masson三色染色及OCN/RUNX2免疫組化（紅色比例尺：500 μm；綠色比例尺：100 μm；N：新骨；F：纖維組織；S：殘留支架）；（B）缺損部位3D顯微CT重建（紅色比例尺：500 μm）；（C）顯微CT定量參數(shù)：骨體積分數(shù)（BV/TV，%）、骨小梁數(shù)量（Tb.N，mm?1）、骨小梁厚度（Tb.Th，mm）。（結果表示為均值±標準差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

3. 研究結論

1. 支架優(yōu)化與生物相容性：1% SL為最佳濃度，可維持BMSCs活力（>95%）并顯著促進成骨分化；PCL/nHA/SL支架在28天降解過程中維持pH 5.8–6.6（輕度酸性），持續(xù)釋放低濃度Ca2?，無明顯細胞毒性。
2. 成骨分化增強：基礎條件下，PCL/nHA/SL支架14天鈣沉積是PCL/nHA的2.1倍；成骨誘導條件下，21天鈣沉積是PCL/nHA的2.4倍；ALP活性從7天起提升2.4–2.7倍，成骨標志物（Runx2、COL1A1、OCN、OPN）呈階段特異性上調(diào)（早期Runx2/COL1A1先升，晚期OCN/OPN后升）。
3. 乳酸化調(diào)控機制：蛋白質(zhì)組學鑒定出190個蛋白的376個差異乳酸化位點，其中STAT1-K193乳酸化是關鍵：① 乳酸化誘導STAT1胞質(zhì)聚集，延長其半衰期（從3.07 h至4.94 h）；② 破壞STAT1與RUNX2的結合，解除對RUNX2的抑制，激活成骨轉錄程序；③ K193是唯一關鍵乳酸化位點，K193R突變體可完全阻斷乳酸誘導的成骨效應。
4. 體內(nèi)骨再生效果：PCL/nHA/SL支架12周可實現(xiàn)臨界尺寸顱骨缺損的近完全修復，形成致密有序的骨小梁網(wǎng)絡；顯微CT顯示BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著高于對照組（P<0.01 vs 空白對照，P<0.05 vs PCL/nHA），免疫組化證實OCN/RUNX2持續(xù)高表達。
5. 研究意義：提出“3D打印結構+乳酸代謝重編程”的新型生物材料策略，首次揭示非組蛋白（STAT1）乳酸化介導的代謝-表觀遺傳串擾機制，為骨組織工程提供可轉化的修復平臺。

4. 論文信息

• 論文標題：乳酸功能化3D打印PCL/nHA支架通過代謝-表觀遺傳串擾驅(qū)動BMSC成骨研究
• 作者信息：曾敏^a,b，劉浩^a,b，盧偉^a,b，陳燦^a,b，林章遠^a,b，趙瑞波^a,b,*；^a中南大學湘雅醫(yī)院骨科，中國長沙；^b中南大學湘雅醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，中國長沙；*通訊作者：趙瑞波，郵箱：370781162@qq.com
• 期刊信息：Materials Today Bio，Volume 33, 2025, Article 102101；期刊主頁：www.journals.elsevier.com/materials-today-bio
• DOI：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.102101