二、研究內(nèi)容
2.1 材料與方法
（1）實驗材料
- 羥基磷灰石（HAp）：粉末狀，平均粒徑＜1 μm，分子量502.31 g/mol（Acros Organics，美國）；
- 海藻酸鈉（SA）：低黏度粉末，平均分子量427 kDa（Sigma–Aldrich，意大利米蘭）；
- 膠原肽：魚源（Coll?）與牛源（Coll?），粉末狀，平均分子量2 kDa（Lapi Gelatine S.p.A.，意大利）；
- 細胞與試劑：人真皮成纖維細胞（HDFs）、DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒等（Merck、GIBCO等品牌）。
（2）生物墨水制備
制備兩種生物墨水（HAp/SA/Coll?、HAp/SA/Coll?），三者質(zhì)量比為5.5:10:10：① 將10%（w/v）膠原肽（Coll?或Coll?）溶于蒸餾水，60℃攪拌30 min；② 加入10%（w/v）HAp，充分分散；③ 加入5.5%（w/v）SA，60℃持續(xù)攪拌1 h，室溫溫和攪拌過夜至均一。
（3）表征與測試方法
- FTIR分析：采用Agilent Cary 630 FTIR光譜儀（ATR模式），4000–500 cm?1波數(shù)范圍，分辨率4 cm?1，分析膠原肽化學(xué)結(jié)構(gòu)；
- 流變學(xué)表征：使用MCR 92流變儀（25 mm平行板，間隙50 μm），測試頻率0.05–100 Hz下的黏度（η）、儲能模量（G'）、損耗模量（G''）與剪切應(yīng)力（τ）；
- 3D打印：采用DIW墨水直寫生物3D打印機，27 G錐形噴嘴，氣動擠出；打印參數(shù)見表4，打印后用1%（w/v）CaCl?溶液交聯(lián)10 min；
- 可打印性評估：① 細絲融合測試：打印單層平行細絲（間距1.4–1.8 mm），ImageJ測量細絲融合長度（f?）、厚度（f?）、間距（f_d）；② 宏觀多孔結(jié)構(gòu)（20×20×0.6 mm3方格）：計算可打印性（P?）、擴散率（D?）、收縮率（S）；
- 凝膠分數(shù)分析：打印10×10×1 mm3樣品，交聯(lián)后干燥稱重（W?），蒸餾水浸泡24 h后再次干燥稱重（W_f），凝膠分數(shù)=（W_f/W?）×100%；BCA法定量釋放的膠原肽；
- 溶脹測試：樣品交聯(lián)后稱重（W?），37℃ PBS中浸泡48 h，不同時間點稱重（W?），溶脹率=（W?–W?）/W?×100%；
- 細胞相容性評估：間接細胞毒性測試（刃天青代謝法），檢測HDFs在生物墨水浸提液中的代謝活性。
2.2 結(jié)果與分析
（1）膠原肽FTIR分析
圖1 （A）Coll?和Coll?粉末樣品的FTIR光譜；（B）經(jīng)縮放后的FTIR光譜及相關(guān)吸收峰標(biāo)識（注：縮放方法為扣除背景后，以1629 cm?1共有的最強峰強度歸一化）
兩種膠原肽的FTIR光譜無顯著化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，主要吸收峰位置一致：3250 cm?1、1500–1600 cm?1、500 cm?1，符合膠原蛋白特征吸收區(qū)間（700–1700 cm?1、2800–3500 cm?1）。通過二階導(dǎo)數(shù)分析定位的吸收峰，可歸屬為多肽特征化學(xué)鍵振動（見表1），僅部分峰的相對強度存在微小差異（歸因于氨基酸組成差異）。
| 波數(shù) [cm?1] | 化學(xué)鍵振動模式（拉伸ν/面內(nèi)彎曲δ） |
|---|---|
| 861 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 921 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 965 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 1021 | ν(C-O) |
| 1077 | ν(C-O) |
| 1200 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1234 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1319 | δ(CH?)、δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1387 | δ(CH?)、δ(CH?) |
| 1442 | δ(CH?)、δ(CH?) |
| 1517 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1629 | ν(C=O) |
| 2870 | ν(C-H)、ν(CH?) |
| 2933 | ν(C-H)、ν(CH?)、ν(O-H) |
| 3056 | ν(C-H)、ν(N-H)、ν(O-H) |
| 3270 | ν(O-H) |
| 3322 | ν(N-H) |
表1 膠原肽FTIR吸收峰位置及對應(yīng)化學(xué)鍵振動模式
（2）生物墨水流變學(xué)表征
圖2 溶液在0.4–100 Hz頻率范圍內(nèi)的流變學(xué)表征：（A）黏度與剪切應(yīng)力；（B）儲能模量（G'）與損耗模量（G''）
① 頻率＜0.3 Hz時，兩種墨水測試數(shù)據(jù)不穩(wěn)定（黏度隨機驟降），故僅分析0.4–100 Hz數(shù)據(jù)；② 兩者均為非牛頓剪切變稀流體：頻率升高時，黏度顯著降低，剪切應(yīng)力明顯升高；其中Coll?基墨水黏度略高于Coll?基墨水；③ 黏彈性：兩者均表現(xiàn)為"類固體行為"（全頻率范圍G'＞G''），G'隨頻率適度升高，G''基本不隨頻率變化；該特性保障擠出時細絲結(jié)構(gòu)完整性。
（3）可打印性評估
圖3 （A）HAp/SA/Coll?墨水、（B）HAp/SA/Coll?墨水的細絲融合測試結(jié)果；（C）兩種墨水的f?/f?與f_d關(guān)系圖（***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05）
細絲融合測試：相鄰細絲存在輕微融合趨勢，且隨間距（f_d）減小更顯著；f_d=1.4 mm（最小間距）時，HAp/SA/Coll?墨水的f?顯著低于HAp/SA/Coll?墨水（p≤0.001），表明其打印分辨率更優(yōu)，可構(gòu)建更精細結(jié)構(gòu)。
圖4 （A）HAp/SA/Coll基墨水打印20×20×0.6 mm3方格的過程；（B）兩種墨水打印方格在交聯(lián)前后的可打印性評估
| 墨水類型 | 可打印性（P?） | 擴散率（D?） | 收縮率（S, %） |
|---|---|---|---|
| HAp/SA/Coll? | 0.82±0.01 | 39.51±3.41 | 13.62±1.41 |
| HAp/SA/Coll? | 0.85±0.01 | 43.72±3.39 | 12.88±0.85 |
表2 兩種生物墨水的可打印性評估參數(shù)（均值±標(biāo)準差；P?：可打印性，D?：擴散率，S：收縮率）
方格結(jié)構(gòu)打?。孩?兩種墨水P?均接近1.0（良好可打印性），HAp/SA/Coll?墨水的P?（0.85±0.01）顯著高于HAp/SA/Coll?墨水（0.82±0.01，p≤0.001），表明其孔隙可打印性更優(yōu)；P?＜1.0均因墨水輕微欠凝膠化，導(dǎo)致孔隙呈圓形而非方形；② 擴散率（D?）：HAp/SA/Coll?墨水的D?（39.51±3.41）顯著低于HAp/SA/Coll?墨水（43.72±3.39，p≤0.01），說明其細絲擴散更少，孔隙閉合效應(yīng)更弱，幾何保形性更優(yōu)；③ 收縮率（S）：兩種墨水收縮率均較低，HAp/SA/Coll?墨水的S（12.88±0.85%）略低于HAp/SA/Coll?墨水（13.62±1.41%），交聯(lián)后形狀保留更優(yōu)。
